Лабораторно — 11
Определение ингибирующих веществ в молоке
Цель занятия. Изучить методику (микробиологическую) определение ингибиторов в молоке.
Задачи: 1.Встановиты как антибиотики, дезинфицирующие вещества и другие факторы, есть в молоке влияют на ход реакции на ингибиторы.
Оборудование и материалы. Пробы сырого молока, пробирки стеклянные (высота 150 и диаметр 16мм), штатив для пробирок, колбы мерные на 200см3; пипетки, редуктазник или водяная баня, обеспечивающих регулирование температуры от 30 до 50 º С термометры, мерные цилиндры на 100 и 200 мл, тест — культура коллекционная (штамм В — 2095 или штамм К, Streptoccocus thermophilus), вода дистиллированная антибиотики (пенициллин (бензилпенициллина калиевая или натриевая соль)), сода.
Для определения ингибирующих веществ в сыром молоке с резазурином: Основной раствор резазурину, препарат сухой для контроля определения ингибирующих веществ в молоке (Скира).
Для определения ингибирующих веществ в сыром молоке с метиленовым голубым: пептон сухой ферментативный для бактериологических целей и приготовленную из него смеси для определения ингибирующих веществ в молоке с метиленовым голубым.
Приготовление всех необходимых рабочих розчнив и тест-культур приведены в приложении Г.
Справочный материал. Антибиотики попадают в молоко, в основном при лечении мастита (воспаления Молочной железы) у коров. Прежде всего это опасно для здоровья людей, и в первую очередь для детей. Так постоянное употребление молока, содержащего антибиотики может вызвать нечувствительность к ним человеческого организма, в лечебного препарата и привести к образованию в организме человека устойчивых к антибиотиков Патогенных бактерий и вызвать изменения в составе кишечной микрофлоры.
Дезинфицирующие вещества в молоко попадают в молоко с продезинфицированы и плохо ополиснутого после дезинфекции молочного оборудования.
В технологическом плане антибиотики и дезинфицирующие в молоке являются нежелательными, и потому что они влияют на молочное брожение, и тем самым ухудшают качество молока, как сырья для производства молочных и кисломолочных продуктов.
Определение ингибирующих веществ в сыром молоке проводят двумя методами: с индикаторами резазурином и метиленовым голубым (согласно ГОСТ 23454-79).
Стандарт распространяется на молоко и включает методы определения ингибирующих веществ, к которым относят антибиотики, формалин, перекись водорода и другие моющие, дезинфицирующие и консервирующие вещества.
Для проведения анализа отбирают 50см3 молока средней пробы можно хранить в холодильнике при температуре 6-8 ° С не более суток.
Метод определения ингибирующих веществ с индикатором резазурином.
Сущность метода. Метод основан на восстановлении резазурину при развитии в молоке чувствительных к ингибирующих веществ микроорганизмов рода St. thermophilus (термофильный стрептококк). Чувствительность метода позволяет определить в молоке наличие антибиотиков и остатков дезинфицирующих веществ.
Рис. St. Thermophilus (Термофильный стрептококк)
Проведения анализа. В чистые пробирки наливают по 10см3 молока и закрывают стерильными резиновыми пробками. Остальные пробы сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре 6-8 º С. Одновременно проводят контрольный анализ. Для этого в пробирку наливают 10см3 восстановленного препарата (Скира), полученного растворением сухого препарата во флаконе с 10см3 дистиллированной воды при температуре 50 º С.
Пробирки с опытным молоком и контрольной пробой нагревают на водяной бане до 85-90 º С. Затем охлаждают до
43-45 º С и стерильной пипеткой в пробирки вносят 0,3 см3 рабочей тест-культуры. Содержимое пробирки перемешивают трехкратным переворачиванием и выдерживают в течение 2 ч в редуктазнику или на водяной бане при температуре 42-43 º С.
В пробирки с молоком и контрольной пробой вносят по 1см3 0,05%-ного раствора резазурину при температуре 18-20 º С. Содержимое пробирок перемешивают двукратным переворачиванием. Пробирки выдерживают в редуктазнику или на водяной бане в течение 15 мин при температуре 42-43 º С.
Обработка результатов. При отсутствии ингибирующих веществ исследуемое молоко будет розовым или белым. При наличии ингибирующих веществ молоко будет иметь сине-стальной, сине-фиолетовое или фиолетовую окраску.
Метод позволяет выявить в молоке содержание пенициллина более 0,01 МО/см3; стрептомицина от 30 до 50мкг/см3; тетрациклина, окситетрациклина — 1МЕ/см3; олеандомицина — 10МЕ/см3; массовую долю пероксида водорода — 0,01%; массовую долю формалина — 0,003% ..
Метод определения ингибирующих веществ с метиленовым голубым
Сущность метода.
Проведения анализа. В чистые пробирки наливают 10 см3 исследуемого молока и закрывают (неплотно) резиновыми пробками. Пробирки с исследуемым молоком нагревают на водяной бане до 87 ± 2 º С с выдержкой до 10 мин и охлаждают до 43 ± 2 º С. После этого в пробирки стерильной пипеткой вносят по 2 см3 приготовленной смеси для определения ингибирующих веществ в молоке с метиленовым голубым, перемешивают трехкратным переворачиванием и выдерживают на водяной бане от 1ч 40 мин до 2 ч 20 мин при температуре 41-42 º С.
Обработка результатов. При отсутствии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь белый цвет. Синее кольцо, образующегося в пробирке на поверхности молока высотой 1 см, в расчет не берут.
Последовательность выполнения работы
Задание 1. Исследовать пробы сырого молока на наличие или отсутствие ингибирующих веществ в них.
После проведения анализа результаты занести в таблицу.
Таблица 14
Результаты обнаружения ингибирующих веществ в пробах сырого молока
|
№ пробы |
Цвет содержимого пробирок в начале реакции |
Цвет содержимого пробирок на конец реакции |
Ингибирующие вещества |
|
Отсутствуют |
Имеющиеся |
||
Вывод.
Вопросы для самоконтроля.
1.Что относят к ингибирующих факторов в молоке?
2.Как они влияют на качество молока?
3.В чем сущность метода определения ингибирующих веществ с индикатором резазурином?
4.Почему антибиотики и другие несвойственные для молока химические соединения в молоке называют ингибиторами?
Нормативные ссылки.
ДСТУ 3662 — 97 Молоко коровье цельное. Требования при закупках.
ДСТУ ISO 707 — 2002 МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. Руководство по отбору проб.
ДСТУ ISO 5538:2004 МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. Отбор проб. Контроль по качественным признакам.
ДСТУ ISO 13969:2005 (IDF 183:2003) МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. Руководство по стандартизированного описания испытания ингибиторов микроорганизмов.
ГОСТ 13928 — 84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу. (Молоко и сливки, заготовляют. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к контроля).
ГОСТ 23454 — 79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ.
ГОСТ 26809 — 86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу.