15

Определение бактериального загрязнения молока. Постановление редуктазнои пробы с метиленовым синим и резазурином. Контроль пастеризации молока: фосфатазна и Пероксидазная пробы молока.

Цель: Усвоить методики определения бактериального загрязнения молока с помощью редуктазнои и резазуриновои проб.

Справочный материал

Определение бактериальной загрязненности молока и редуктазною пробоя (ГОСТ 9225-84)

Проба на редуктазу — это косвенный показатель бактериальной загрязненности, основанный на биохимической активности микроорганизмов. Определяют ее двумя способами: с редуктазною пробой с метиленовым синим и резазурином.

Суть методов заключается в способности фермента редуктазы, который выделяют микроорганизмы, обесцвечивать органические красители метиленовый синий и резазурин. Зависимости от времени обесцвечивания или изменения обесцвечивания определяют бактериальную загрязненность молока.

Редуктазна проба с метиленовым синим.

Приборы и реактивы. Весы лабораторные четвертого класса точности ценой деления не более 0,05 г; термостат жидкостный, который поддерживает температуру в пределах 15-55 ° С с отклонением от заданной температуры ± 1 ° С; редуктазник, позволяющий поддерживать температуру 25-55 ° С; водяная баня; термометры стеклянные жидкостные от 0 до 100 ° С с ценой деления И ° С; пробки резиновые конусные, пипетки первого и второго классов точности вместимостью на 1, 5, 10, 20см3; пробирки типа ПИ, П2 диаметром 16 мм, высотой 150 и диаметром 21, высотой 200 мм мерные цилиндры на 100 и 200 см3; метиленовый синий — индикатор; спирт этиловый 96% раствор, вода дистиллированная.

Для проведения редуктазнои пробы с метиленовым синим готовят водный раствор с массовой концентрацией метиленового синего 0,005 г/см3. То есть берут 1 г метиленового синего и растворяют в 200 см3 дистиллированной воды. Срок хранения приготовленного раствора не более 12 мес в стаканах, защищенных от света.

Для приготовления рабочего раствора метиленового синего с массовой концентрацией 0,00015 г/см3 принимают 6 см3 раствора с массовой концентрацией 0,005 г/см3 и заставляют из 194 см3 дистиллированной воды. Срок хранения приготовленного раствора не более 30 суток в холодильнике,

Ход определения. В стерильные пробирки наливают по 1 см3 рабочего раствора метиленового синего и по 20 см3 исследуемого молока, отобранного в стерильную посуду и с помощью стерильных приспособлений закрывают резиновыми пробками и смешивают медленным трехкратным переворачиванием пробирок. Пробирки переносят в редуктазник с температурой воды 37 ± 1 ° или водяную баню, которую размещают в термостате с такой же температурой. Вода в редуктазнику или в водяной бане должна быть на уровне или чуть выше жидкости в пробирках. Пробирки с молоком защищают от действия света. Началом анализа считается момент погружения пробирок в редуктазник. Наблюдение за изменением окраски ведут через 40 мин., 2,5 и 3,5 час. Окончание анализа будет обесцвечивания раствора. При этом небольшой кольцеобразный слой сверху и снизу пробирки шириной не более 1 см3, который остался окрашенным, в расчет не берут. Появление окраски в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

Зависимости от времени обесцвечивания молоко относят к одному из четырех классов.

Количество бактерий в Молоке и его класс по редуктазною пробой с метиленовым синим

Редуктазна проба с резазурином.

Приборы и реактивы. Приборы аналогичные определению редуктазнои пробы с метиленовым синим: весы лабораторные второго класса с ценой деления не более 0,001 г резазуринонатриева соль или резазурин в таблетках.

Основной раствор резазурино-натриевой соли готовят так: 100 мг резазурино-натриевой соли переносят в мерную колбу на 200 см3 и доводят до метки кипяченой и охлажденной до 25 +2 ° С дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают. Срок хранения основного раствора резазуринонатриевои соли не более 30 суток при температуре 8-10 ° С.

Рабочий раствор резазурину готовят разведением основного раствора кипяченой и охлажденной водой (дистиллированной) до 25 ± 2 ° С соотношении 1:2,5 (например, в 10см3 основного раствора добавляют 25 см3 воды). Массовая доля резазурину в рабочем растворе 0,014%.

При использовании резазурину в таблетках для приготовления рабочего раствора одну таблетку растворяют в 50 см3 кипяченой и охлажденной до 25 ± 2 ° С дистиллированной воды. Массовая доля резазурину в рабочем растворе 0,01%. Срок хранения рабочего раствора резазурину не более 3 суток при температуре 0-5 ° С. Основной и рабочий раствор хранят в банках, защищенных от света.

Ход определения. Пробу с резазурином следует проводить не ранее чем через 2 ч. после доения. В пробирку наливают по 1 см3 рабочего раствора резазурину и по 10 см3 исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают медленным трехкратным переворачиванием пробирок. Пробирки переносят в редуктазник с температурой воды 37 ± 1 ° С или водяную баню, которую размещают в термостате с такой же температурой. Вода в редуктазнику или водяной бане после погружения пробирок с молоком должна быть на уровне или чуть выше уровня жидкости в пробирках. Пробирки с молоком защищают от воздействия прямых солнечных лучей. Началом анализа считают время погружения пробирок в редуктазник. Показатель снимают через 1 и 1,5 часа. Пробирки с молоком, которые через 1 час. имеют от серо-сиреневого до сиреневого с серым оттенком окраску, оставляют в редуктазнику еще на 30 мин.

Зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета определяют класс молока согласно требованиям, приведенным в таблице.

Вопросы для самоконтроля Как попадает в молоко фермент редуктаза? Как делится молоко по бактериальному загрязнению? Как ставят редуктазну пробу с метиленовой синью? Как ставят редуктазну пробу с резозурином? При какой температуре Молока определяют бактериальную загрязненность молока? Для чего и как ставят Пероксидазную и фосфотазну пробы молока?

Литература

ДСТУ3662-97 Молоко коровье Цельное. Требования при закупках ? Кугенев П. В., барабанщиков Н. В. Практикум по молочному делу. — М.: Колос, 1968. — 287 с.